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概述

          單核-巨噬系統（Mononuclear Phagocyte System，MPS），是由一組具有共同起源、形態和功能的細胞組成的系統。這些細胞主要負責吞噬和消化體內的病原體、死細胞和異物，參與免疫防御和組織修復。近年來，隨著對單核巨噬細胞的深入研究，發現巨噬細胞與多種疾病有關，包括代謝、自身免疫、癌癥等疾病均具有重要調控作用，因此，針對單核巨噬細胞的靶向遞送對于相關領域的藥物開發、疾病機制研究至關重要。mRNA in vitro，幫助單核巨噬細胞研究進入新的周期，實現敲低和過表達，為單核巨噬細胞靶點驗證提供保障。為解決更多單核巨噬細胞靶點的體內概念驗證和成藥研究，多納醫藥基于自有知識產權的核酸遞送技術，開發了用于體內單核巨噬細胞遞送的CALNP? MPS-LNP制劑服務，為更多單核巨噬細胞研究的體內驗證提供支持和保障。

研發流程

1、靶點調研

2、體外序列篩選

3、最優序列合成

4、CALNP? MPS-LNP制備

5、動物模型驗證

已驗證數據

1、CALNP? MPS-LNP制劑理化性質

2、體外巨噬細胞CALNP? MPS-LNP轉染效率研究

選用RAW264.7、J774和MH-S三種小鼠巨噬細胞計數種板，貼壁培養過夜，換液加入含有不同濃度的CALNP? MPS-LNP（包裹X-siRNA，X為巨噬細胞特異性表達蛋白）轉染24 h后檢測細胞X-mRNA水平，結果顯示高、低濃度CALNP? MPS-LNP孵育均可顯著敲低三種巨噬細胞敲低X-mRNA水平，其中高濃度組減少約80% mRNA表達。

圖1. 三種巨噬細胞體外孵育CALNP? MPS-LNP敲低巨噬細胞相關基因mRNA水平。

3、體內系統給藥遞送CALNP? MPS-LNP制劑——連續兩次給藥（PK-PD研究）

C57BL/6J小鼠腋下接種5×10⁵個CT26細胞，待腫瘤體積增長至300~500 mm³，給予小鼠包載Cy5-siRNA的CALNP? MP-LNP制劑，隔天給藥一次，劑量為1 mg/kg。兩次給藥后，在6小時、24小時和48小時的時間點對小鼠離體臟器進行熒光強度測定，發現除心臟以外，其他臟器在注射后的6小時均顯示出強烈的Cy5熒光信號，并在此時達到最高值。特別地，在肝臟、脾臟和腫瘤組織中，Cy5熒光信號的持續時間較長，至24小時甚至48小時后仍可檢測到。

圖2. CT26荷瘤小鼠連續兩次給予Cy5-siRNA-CALNP? MPS-LNP后不同時間點離體臟器熒光強度。

對熒光分布較多的肝、脾和腫瘤組織，進行消化后，測定不同時間點CD11b+/CD45+細胞內Cy5熒光強度與F4/80的關系。可見Cy5陽性細胞主要為F4/80陽性的巨噬細胞，在肝和脾中分別于1h和6h有最大Cy5陽性細胞比例，對于腫瘤，在6h、24h和48h均有明顯Cy5陽性巨噬細胞的積累。與離體組織熒光成像結果一致。

圖3. CT26荷瘤小鼠連續兩次給予Cy 5-siRNA-CALNP? MPS-LNP后不同時間點腫瘤組織內巨噬細胞Cy5熒光強度變化。

圖5. CT26荷瘤小鼠連續兩次給予Cy 5-siRNA-CALNP? MPS-LNP后不同時間點脾臟組織內巨噬細胞Cy5熒光強度變化。

離體組織裂解后進行RNA提取和RT-qPCR檢測，結果顯示脾臟、肝臟和腫瘤組織中給藥后6 h和24 h可敲低目標基因50%~80%，其中6 h敲低效果最明顯。

圖6. CT26荷瘤小鼠連續兩次給予Cy 5-siRNA-CALNP? MPS-LNP后不同時間點各臟器組織內敲低基因mRNA水平變化。

 4、體內系統給藥遞送CALNP? MPS-LNP制劑——連續多次給藥（Efficacy研究）

C57BL/6J小鼠腋下接種5×10⁵個CT26細胞，待腫瘤體積增長至~150 mm³，給予小鼠包載X-siRNA的CALNP? MP-LNP制劑，隔天給藥一次，劑量為1 mg/kg。從腫瘤生長曲線可見，從第四次給藥開始，給與siRNA藥物組相比較與對照組腫瘤生長顯著被抑制并持續到末次給藥，兩組動物體重均正常增加，實驗給藥過程中無動物死亡。

圖7.MC38荷瘤小鼠多次給予siRNA-CALNP? MPS-LNP（治療性）后腫瘤生長曲線和體重增長曲線。

實驗終點分離臟器組織進行消化提取RNA后采用RT-qPCR方法檢測不同臟期內目標敲低基因mRNA表達水平，結果顯示脾臟、肝臟和腫瘤組織中給藥組相較于對照組目標基因敲低明顯，其中脾臟表達抑制最多，約65%；肝臟和腫瘤組織中RNA表達抑制約為30%。

圖8. MC38荷瘤小鼠多次給予siRNA-CALNP? MPS-LNP（治療性）后終點不同組織敲除基因mRNA水平測定。

同時，在實驗終點也收集了動物血漿進行血生化和血細胞計數分析，結果顯示兩組間各個指標均無顯著差異，結合給藥期間動物體重的正常增加顯示siRNA-CALNP? MPS-LNP制劑安全性良好，動物均可耐受。