產品與服務
產品概述
本品是利用M-MLV反轉錄酶的反轉錄試劑盒，cDNA產物可直接用于qPCR檢測。qRT SuperMix中包含反轉錄反應所需的所有組分，并針對Oligo dT(18T) Primer、 Random 6 mers Primer用量進行了優化，使反轉錄產物兼容染料嵌合法和探針法qPCR檢測，能夠進行高效的基因表達分析。在進行下游定量PCR實驗中，Total RNA中混入的基因組 DNA（gDNA）可直接作為反應的模板進行擴增，可能會造成實驗結果的假陽性。本品中gDNA Eraser Mix可有效去除殘留的基因組DNA，確保定量結果的準確性，本品中配有NRT Control Mix，可用于配制無反轉錄酶的陰性對照反應。
產品組成
試劑盒組成 | FZ019-10 | FZ019-100 |
gDNA Eraser Mix*1 | 24 μL *1 | 240 μL *1 |
5X qRT SuperMix*2 | 40 μL*1 | 400 μL*1 |
NRT Control Mix *3 | 8 μL*1 | 80 μL*1 |
RNase free water | 1 mL*1 | 1 mL*2 |
*1：gDNA Eraser Mix可搭配 5X qRT SuperMix或NRT Control Mix 使用。
*2：該溶液含有Evo M-MLV RTase、RNase Inhibitor、dNTPs、Oligo dT (18T) Primer與Random 6 mers Primer
*3：該溶液不含Evo M-MLV RTase， 其余組分與 5X qRT SuperMix完全相同
儲存及運輸條件
冰袋運輸。試劑置于-20 ℃保存，有效期18個月。
操作方法
1. 去基因組DNA與反轉錄反應
本產品有兩種使用方法，可根據需求進行選擇。操作如下：
l 方法一： All in one（去除gDNA與反轉錄反應同時進行）
當RNA質量較高（gDNA殘留少），或反應中RNA濃度較高、目標基因拷貝數較高時，可將去除gDNA與反轉錄合為一步操作。
按照下表配制反應液*1、 *2，同時進行基因組DNA去除與反轉錄反應。
組分名稱 | 20μL體系 |
gDNA Eraser Mix | 2 μL |
5X qRT SuperMix | 4 μL |
Total RNA*3 | - |
RNase free water | up to 20 μL |
反應條件
步驟 | 溫度 | 時間 |
1 | 37 ℃ | 15 min |
2 | 85 ℃ | 5 sec |
3 | 4 ℃ | Hold*4 |
*1：反應體系可以根據需要進行調整，各組分按比例變更即可
*2：配制試劑時，建議加樣順序按照RNase free water、gDNA Eraser Mix、 5X qRT SuperMix依次添加，配制完成后用移液器輕柔吸打混勻，混勻后加入 RNA 模板。NRT Control 是指無反轉錄酶的陰性對照反應，可根據實際需要進行配制。配制時，將5X qRT SuperMix替換成 NRT Control Mix 即可
*3：Total RNA 可根據需要添加，提取的 RNA 建議使用 RNase free water 進行溶解。在20μl 反轉錄體系中，使用 SYBR 法進行qPCR擴增時，建議Total RNA加入量不超過 1μg；使用探針法進行qPCR擴增時，建議Total RNA加入量不超過 2μg。
*4：反應產物如立即用于后續 qPCR 反應，可暫放于 4℃或冰上；如短期保存建議放置于-20℃；如長期保存建議放置于-80 ℃。
l 方法二：兩步法（先去除gDNA，再進行反轉錄）
1.1 去除gDNA
按照下表配制反應液*1、*2，進行基因組DNA去除反應。
組分名稱 | 20μL體系 |
gDNA Eraser Mix | 2 μL |
Total RNA*3 | - |
RNase free water | up to 16 μL |
反應條件
步驟 | 溫度 | 時間 |
1 | 42 ℃ | 2 min |
2 | 4 ℃ | Hold*4 |
*1：反應體系可以根據需要進行調整，各組分按比例變更即可
*2：配制試劑時，建議先將gDNA Eraser Mix與RNase free water配制成預混液，用移液器輕柔吸打混勻后，再加入RNA模板。
*3：Total RNA可根據需要添加，提取的RNA建議使用RNase free water進行溶解。在20μl 反
轉錄體系中，使用SYBR法進行qPCR擴增時，建議Total RNA加入量不超過1μg；使用探針法進行qPCR擴增時，建議Total RNA加入量不超過2μg。
*4：反應產物取出后置于冰上，立即進行后續反轉錄反應
1.1 反轉錄反應
配制反轉錄反應液*1，置于 PCR 儀進行反轉錄反應。
組分名稱 | 20μL體系 |
步驟1. 去除gDNA反應液 | 16 μL |
5X qRT SuperMix*2 | 4 μL |
Total | 20 μL |
反應條件
步驟 | 溫度 | 時間 |
1 | 37 ℃ | 15 min*2 |
2 | 85 ℃ | 5 sec*3 |
3 | 4 ℃ | Hold |
*1：反應體系可以根據需要進行調整，各組分按比例變更即可。
*2：NRT Control 是指無反轉錄酶的陰性對照反應，可根據實際需要進行配制。 配制時，將5X qRT SuperMix替換成 NRT Control Mix 即可
*3：若反應產物立即用于后續 qPCR反應，可暫放于4℃或冰上；如短期保存建議放置于-20℃，如需長期保存建議放置于-80℃。
2. 定量 PCR 分析
經上述反轉錄過程得到的 cDNA 可以直接進行定量 PCR 分析。推薦搭配本公司產品 SYBR Green qPCR premix試劑盒使用。
